蛋白质定量检测是生命科学研究、临床诊断及生物制药领域的核心技术，其中相对定量与绝对定量因检测目的不同，在样本处理流程和检测方法选择上存在显著差异。本文将系统梳理两种定量方式的样本处理关键步骤，详解常用检测方法的原理与应用场景，为相关研究和实践提供清晰的操作指引与方法选择依据。
蛋白质定量检测的核心概念：相对定量与绝对定量
蛋白质相对定量主要用于比较不同样本中目标蛋白质的表达差异，无需获取蛋白质的具体浓度值，仅需通过参照标准（如内参蛋白、标记物）计算目标蛋白在样本间的相对比值，常见于差异蛋白筛选、药物作用机制研究等场景。
蛋白质绝对定量则需获取目标蛋白质在样本中的准确浓度（如ng/mL、pmol/L），通常依赖已知浓度的标准品建立定量模型，适用于临床诊断标志物定量、药物含量检测、代谢通路关键蛋白浓度分析等场景。
蛋白质检测的样本处理流程（相对定量与绝对定量通用基础步骤）
样本处理是蛋白质定量检测的前提，直接影响检测结果的准确性和重复性，两者通用基础流程包括样本采集、裂解、提取、去杂质四个核心环节，仅在部分细节上存在差异。
1. 样本采集：需根据样本类型（细胞、组织、血液、体液等）选择合适方式，如细胞样本需用胰酶消化后离心收集，组织样本需液氮研磨破碎，血液样本需离心分离血清/血浆；采集后需立即低温（-20℃或-80℃）保存，避免蛋白降解。
2. 样本裂解：目的是破坏样本结构、释放蛋白质，需选择匹配的裂解液（如RIPA裂解液适用于多数组织细胞，尿素裂解液适用于难溶蛋白），并加入蛋白酶抑制剂（如PMSF、蛋白酶抑制剂 cocktail）防止蛋白水解，裂解过程需在冰上进行，减少蛋白变性。
3. 蛋白提取：通过离心（通常12000-15000rpm，4℃，10-20分钟）分离上清液，上清液即为粗蛋白提取液；若样本含较多脂肪或核酸，需额外加入去垢剂（如Triton X-100）或核酸酶（如DNase I）去除杂质。
4. 蛋白定量前处理：相对定量需通过BCA法、Bradford法等测定提取液中总蛋白浓度，确保上样量一致；绝对定量对样本纯度要求更高，需通过免疫沉淀、亲和层析等方法纯化目标蛋白，避免杂蛋白干扰标准品与目标蛋白的反应。
蛋白质相对定量的常用检测方法
蛋白质相对定量方法以“参照对比”为核心，通过标记或内参校准实现样本间差异比较，以下为三种主流方法的原理与操作要点。
1. Western Blotting（免疫印迹法）：基于抗原-抗体特异性结合，将蛋白样本通过SDS-PAGE电泳分离后转移至膜上，用特异性一抗结合目标蛋白，再用二抗（偶联荧光或化学发光基团）检测；通过内参蛋白（如GAPDH、β-actin）校准上样量，利用灰度分析软件计算目标蛋白与内参蛋白的灰度比值，实现不同样本间的相对定量。该方法操作简便、成本较低，适用于单一或少量目标蛋白的相对定量。
2. 双向凝胶电泳（2-DE）结合质谱法：先通过等电聚焦（根据蛋白等电点分离）和SDS-PAGE（根据蛋白分子量分离）实现蛋白分离，得到二维凝胶图谱；用图像分析软件比较不同样本凝胶中蛋白斑点的灰度值，差异斑点即为表达变化的蛋白；再通过质谱鉴定差异蛋白，适用于大规模差异蛋白筛选，但重复性较低，对低丰度蛋白检测灵敏度有限。
3. 同位素标记相对定量（iTRAQ/TMT）：通过同位素标记试剂（如iTRAQ标记4-8个样本，TMT标记2-16个样本）与蛋白酶解后的肽段结合，标记后的肽段通过液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）检测；根据不同同位素标记的信号强度比值，计算同一肽段在不同样本中的相对含量，进而得到目标蛋白的相对定量结果。该方法通量高、重复性好，可同时对多个样本的上千种蛋白进行相对定量。
蛋白质绝对定量的常用检测方法
蛋白质绝对定量方法以“标准品校准”为核心，需建立目标蛋白浓度与检测信号的线性关系，以下为三种精准度较高的方法。
1. 同位素稀释质谱法（ID-MS）：将已知浓度的稳定同位素标记的目标蛋白/肽段（内标）加入样本中，与样本中的天然目标蛋白/肽段共同酶解、分离后，通过LC-MS/MS检测两者的信号强度比值；根据内标浓度和信号比值，计算出样本中天然目标蛋白的绝对浓度。该方法特异性强、准确性高，是蛋白质绝对定量的“金标准”，适用于精准度要求高的场景（如临床诊断标志物定量）。
2. 外标法（标准曲线法）：配制一系列已知浓度的目标蛋白标准品，与样本在相同条件下进行检测（如ELISA、Western Blotting）；以标准品浓度为横坐标，检测信号值（如吸光度、灰度值）为纵坐标绘制标准曲线；根据样本的检测信号值，在标准曲线上查得目标蛋白的绝对浓度。该方法操作简便，适用于有商业化标准品的单一目标蛋白定量，但易受样本基质干扰。
3. 标准加入法：向样本中加入不同浓度的目标蛋白标准品，配制为“样本+标准品”的系列混合液，在相同条件下检测；以加入的标准品浓度为横坐标，检测信号值为纵坐标绘制曲线，将曲线外推至信号值为零的点，对应的横坐标绝对值即为样本中目标蛋白的原始浓度。该方法可消除样本基质对检测的干扰，适用于基质复杂的样本（如血浆、组织匀浆）中目标蛋白的绝对定量。
相对定量与绝对定量的样本处理及方法选择建议
在实际应用中，需根据研究目标和样本特性选择合适的定量方式及配套流程，以确保检测结果符合需求。
1. 样本处理差异选择：相对定量对样本纯度要求较低，粗提蛋白即可满足多数方法（如Western Blotting、iTRAQ）需求；绝对定量需去除样本基质干扰，若采用ID-MS或标准加入法，需通过免疫纯化、层析等步骤获得高纯度目标蛋白，避免杂蛋白影响标准品信号。
2. 检测方法选择依据：若研究目的是比较不同样本（如正常组与疾病组）的蛋白表达差异，且无需具体浓度，优先选择Western Blotting（少量蛋白）或iTRAQ/TMT（大量蛋白）；若需获取蛋白准确浓度（如药物剂量检测、临床标志物诊断），优先选择ID-MS（精准度高）或外标法（成本低、操作简），基质复杂样本建议搭配标准加入法。
3. 结果验证建议：相对定量结果可通过不同内参蛋白（如GAPDH、β-tubulin）交叉验证；绝对定量结果建议用两种不同方法（如ID-MS与ELISA）进行比对，确保浓度值的准确性，减少方法特异性误差。